C18這種固定相目前主導了HPLC柱市場(chǎng)，雖然不斷有新的固定相被創(chuàng )造出來(lái)推向市場(chǎng)，C18目前仍占有50-60%的市場(chǎng)。在USP數據庫中，收錄的L1有接近800種（L1主要是C18，也含有一些極性封端和極性嵌入的C18，點(diǎn)擊進(jìn)入USP收錄的L1型色譜柱），而且這個(gè)數據在不斷增長(cháng)。

       在我的實(shí)際工作中，有遇到不少由于使用不當或者不可避免的因素而導致色譜柱峰形變差、柱效下降、柱壓升高等情況。色譜柱是一種耗材，肯定是有一定的壽命的，有些時(shí)候遇到這種情況，的成本（特別是儀器緊張時(shí)的時(shí)間成本）可能也挺高，而且不一定有效。

      據說(shuō)在有些歐美藥企，為了保證數據重復性，色譜柱是規定了使用次數的，到使用次數了就換，不管柱子還能不能繼續使用。但是對于國內，一支進(jìn)口色譜柱的成本可能就是一個(gè)實(shí)驗人員半個(gè)月或者一個(gè)月的工資了，企業(yè)不得不考慮色譜柱的成本問(wèn)題；另外對于很多經(jīng)費有限的高校的學(xué)生也是這樣，可能一支柱子要伴隨他/她的整個(gè)研究生歲月。有時(shí)候下班了還會(huì )接到他們焦慮的電話(huà)：我的柱子出問(wèn)題了，還能不能搶救一下？

，我會(huì )讓他們給我幾個(gè)信息:

1. 色譜柱的背壓（backpressure）是否有明顯升高？在這里，建議使用者在新柱子開(kāi)封后先按照柱報告的條件測試一下柱子，如果出現柱效或者保留時(shí)間等與柱報告上的數據差異較大，可以聯(lián)系供貨商進(jìn)行售后；同時(shí)可以記錄下在這臺儀器上測試時(shí)的背壓情況，這就可以作為背壓升高情況的參考值；

2.是否所有的色譜峰都出現了拖尾或者變形（如肩峰或裂峰），如下圖:

圖一拖尾峰和變形峰

有幾種情況：

      1. 只出現現象1，即背壓升高。這種情況不一定是色譜柱的問(wèn)題，那有可能是儀器體系出現了問(wèn)題，比如某些管路出現不通暢；或者使用的流動(dòng)相黏度過(guò)大（如異丙醇）、流速過(guò)大；也有可能是色譜柱老化了（這種情況下色譜柱的背壓是緩慢增加的）；或者使用了高濃度的緩沖鹽或者長(cháng)時(shí)間把柱子保存在含有緩沖液的流動(dòng)相中，這樣會(huì )導致鹽在色譜柱中析出而造成柱壓升高；

       2.只出現現象2，即所有峰都拖尾或者變形，而柱壓基本沒(méi)有上升。這種情況有可能是色譜柱安裝不當，比如死體積過(guò)大或者柱子填充不好，出現柱床塌陷；也有可能色譜柱出現樣品過(guò)載了，這個(gè)時(shí)候可以檢查下進(jìn)樣量是否過(guò)大；也有可能是分析物都是堿性化合物，流動(dòng)相的pH不合適，這時(shí)可以調低pH以抑制填料中硅醇的活性或者增加緩沖液濃度以提高緩沖能力；當然，也有可能是色譜柱的柱頭被強保留的物質(zhì)污染，這個(gè)時(shí)候可能會(huì )出現連續跑空白樣品時(shí)會(huì )在同樣的地方出峰的現象；

       3. 同時(shí)出現現象1和現象2，即色譜柱背壓明顯升高，同時(shí)色譜峰出現拖尾或者變形，這種情況很有可能是色譜柱的篩板堵了或者柱頭污染了。

       在這里，我再強調一遍，解決問(wèn)題的辦法是預防問(wèn)題的產(chǎn)生。出現色譜柱污染或者堵的情況很多時(shí)候是可以避免的，比如安裝在線(xiàn)過(guò)濾器或者保護柱等等，這里就不展開(kāi)講了。下面講一下出現篩板堵了或者柱頭污染了怎么處理，有兩種方法：

      1. 把柱子反過(guò)來(lái)用。這并不適用于所有的柱子，因為有些柱子的兩端篩板的孔隙大小不一致，反沖可能把填料沖出來(lái)而造成柱床塌陷。根據經(jīng)驗，這個(gè)操作可以解決一部分色譜柱的峰拖尾或者變形的問(wèn)題；

       2. 用強洗脫的溶劑沖洗。很多文獻數據認為反相HPLC中溶劑強度順序為：水（弱）< 甲醇 < 乙腈 < 乙醇< si氫呋喃 < 丙醇 < 二氯甲烷（zui強），由于二氯甲烷很強，因此可用于清洗被強保留樣品組分污染的RPC柱。

      一般來(lái)說(shuō)，反沖效果更好，這樣強保留成分就不需要走過(guò)整個(gè)色譜柱了。推薦的保守的清洗方法是：

1、20倍柱體積水：乙腈=95%：5%沖洗柱子，以除去系統中可能殘存的緩沖鹽（如果確定系統中不含緩沖鹽此步驟可以略過(guò)）；

2、異丙醇低流速（至少減半）沖洗，沖洗的時(shí)間視情況而定；

3、20倍柱體積水：乙腈=95%：5%

4、用所需的流動(dòng)相比例重新平衡色譜柱。

      如果用保守的方法沒(méi)有什么效果，又不想放棄這支色譜柱，我這里有一個(gè)參考了好幾本專(zhuān)著(zhù)的方法，其中用到了更強的流動(dòng)相：

1、20倍柱體積水：乙腈=95%：5%沖洗柱子，以除去系統中可能殘存的緩沖鹽（如果確定系統中不含緩沖鹽此步驟可以略過(guò)）；

2、20倍柱體積異丙醇低流速（至少減半）沖洗；

3、20倍柱體積的二氯甲烷：含0.1%氫氧化銨的甲醇=96%：4%沖洗柱子；

4、20倍柱體積異丙醇低流速（至少減半）沖洗；

5、20倍柱體積水：乙腈=95%：5%

6.、用所需的流動(dòng)相比例重新平衡色譜柱。

      關(guān)于二氯甲烷能不能進(jìn)C18色譜柱的問(wèn)題，我去問(wèn)過(guò)有過(guò)這么操作的同行，有的說(shuō)快速沖一下確實(shí)可以很好地清洗柱子，但也有反映說(shuō)沖過(guò)之后柱效損失很大。所以本方法僅供準備后再搶救一把的色譜柱來(lái)嘗試，嘗試完后麻煩也給我反饋下效果。這里有需要注意的是二氯甲烷和水是不互溶的，所以在使用二氯甲烷前后都需要用異丙醇充分過(guò)渡。

      后，關(guān)于柱體積的計算可以找到很多文章來(lái)詳細說(shuō)明，這里就不贅述。附錄一個(gè)全多孔硅膠填料色譜柱的柱體積數據：